Исследователи из Массачусетского технологического института разработали новую методику выращивания небольших колоний живых клеток человеческой печени, с помощью которых можно моделировать поведение полноценно органа. Эта методика может в будущем позволить медикам усовершенствовать методики оценки вреда новых лекарств, наносимого печени человека.
Токсичность по отношению к печени — одна из главных причин отзыва медикаментов из продажи. Потенциально опасные лекарства всегда проходят проверку на токсичность в клинических и предклинических испытаниях, однако в наши дни такие тесты осуществляются на крысах, реакции которых не всегда идентичны человеческим. Применяются в испытаниях и умирающие клетки человеческой печени, однако в лабораторных условиях они выживают всего в течение нескольких дней, так что на результаты тестов не всегда можно положиться.
Новая технология позволяет распределить живые клетки человеческой печени в маленькие колонии на инертной подложке всего полмиллиметра в диаметре.
Такой массив колоний — настоящая «микропечень». В большинстве случаев она ведёт себя как цельный орган и живет в лабораторных условиях до 6 недель.
Сангита Бхатия и Салман Кетани из Массачусетского технологического института доложили о своих достижениях в выпуске Nature Biotechnology, опубликованном online 18 ноября.
Для построения своего модельного массива исследователи использовали технологию создания микрообъектов на поверхности, которая повсеместно используется в микроэлектронике для нанесения дорожек медных проводников на печатные платы. Эта технология позволила ученым с высокой точностью разместить на подложке не только клетки печени, но и различные клетки другого типа, необходимые для нормального функционирования модели.
Одна из главных – образование и выделение желчи, прозрачной жидкости оранжевого или желтого цвета. Желчь содержит кислоты, соли, фосфолипиды (жиры, содержащие фосфатную группу), холестерин и пигменты. Соли желчных кислот и свободные желчные кислоты эмульгируют жиры (т.е. разбивают на мелкие капельки), чем облегчают их переваривание; превращают жирные кислоты в водорастворимые формы (что необходимо для всасывания как самих жирных кислот, так и жирорастворимых витаминов A, D, E и K); обладают антибактериальным действием.
Все питательные вещества, всасываемые в кровь из пищеварительного тракта, – продукты переваривания углеводов, белков и жиров, минералы и витамины – проходят через печень и в ней перерабатываются. При этом часть аминокислот (фрагментов белков) и часть жиров превращаются в углеводы, поэтому печень – крупнейшее «депо» гликогена в организме. В ней синтезируются белки плазмы крови – глобулины и альбумин, а также протекают реакции превращения аминокислот (дезаминирование и переаминирование). Дезаминирование – удаление азотсодержащих аминогрупп из аминокислот – позволяет использовать последние, например, для синтеза углеводов и жиров. Переаминирование – это перенос аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту с образованием другой аминокислоты. В печени синтезируются также кетоновые тела (продукты метаболизма жирных кислот) и холестерин.
Печень участвует в регуляции уровня глюкозы (сахара) в крови. Если этот уровень возрастает, клетки печени превращают глюкозу в гликоген (вещество, сходное с крахмалом) и депонируют его. Если же содержание глюкозы в крови падает ниже нормы, гликоген расщепляется и глюкоза поступает в кровоток. Кроме того, печень способна синтезировать глюкозу из других веществ, например аминокислот; этот процесс называется глюконеогенезом.
Еще одна функция печени – детоксикация. Лекарства и другие потенциально токсичные соединения могут превращаться в клетках печени в водорастворимую форму, что позволяет их выводить в составе желчи; они могут также подвергаться разрушению либо конъюгировать (соединяться) с другими веществами с образованием безвредных, легко выводящихся из организма продуктов. Некоторые вещества временно откладываются в клетках Купфера (специальных клетках, поглощающих чужеродные частицы) или в иных клетках печени. Клетки Купфера особенно эффективно удаляют и разрушают бактерии и другие инородные частицы. Благодаря им печень играет важную роль в иммунной защите организма. Обладая густой сетью кровеносных сосудов, печень служит также резервуаром крови (в ней постоянно находится около 0,5 л крови) и участвует в регуляции объема крови и кровотока в организме.
В целом печень выполняет более 500 различных функций, и ее деятельность пока не удается воспроизвести искусственным путем. Удаление этого органа неизбежно приводит к смерти в течение 1–5 дней. Однако у печени есть громадный внутренний резерв, она обладает удивительной способностью восстанавливаться после повреждений, поэтому человек и другие млекопитающие могут выжить даже после удаления 70% ткани печени.
Чтобы удостовериться, что модель работает идентично целому органу, ткани которого выполняют более пятисот различных функций, ученые также изучили особенности экспрессии генов в тканях этой структуры. Сопоставив их с параметрами свежевыделенных клеток человеческой печени, ученые обнаружили практически полное соответствие, что и дало им возможность говорить о схожести в поведении «микропечени» и настоящего органа в остальных процессах.
Это открытие позволяет применять модель для изучения отклика печени на те или иные лекарства без необходимости клинических испытаний с участием людей.
И хотя для вывода нового лекарства на рынок такие опыты придётся провести, многие небезопасные препараты до этой стадии не доберутся.
Кроме того, длительность жизни каждой такой системы позволит в будущем разработать новые методики тестирования лекарств на совместимость с человеческими органами. Например, можно будет разработать тест, имитирующий процесс длительного принятия небольших доз лекарства, или оценить коллективное влияние на организм одновременно нескольких различных лекарств.
В полупроводниковой индустрии и микромеханике при использовании этой технологии поступают следующим образом. Кремниевую пластину, на которой собираются вытравливать микрообъекты, покрывают слоем специального компонента - так называемого фоторезиста. Затем покрытую фоторезистом пластину облучают светом определенной длины волны, при этом на пути света ставят шаблон, чтобы поверхность фоторезиста оказалась засвеченной лишь в нужных местах.
В результате облучения фоторезист становится растворимым, и эти растворимые участки смываются с поверхности кремния водой. Незасвеченная область не смывается и формирует так называемую маску для химического травления кремния, которое является следующей стадией. В процессе травления кремния свободные от фоторезиста участки растворяются частично или полностью, покрытые же фоторезистом остаются в первозданном виде. В конце процесса фоторезистная маска смывается и на выходе получается кремниевая пластина с нанесенным на неё микроузором.
Комбинации различных приемов химического травления и маскирования поверхности кремния с помощью фоторезиста в ряде случаев могут быть использованы даже для получения на поверхности объектов нанометрового масштаба.
Салман Кетани использовал шаблоны, каждый из которых содержит массив из 24 углублений, в каждом из которых располагается матрица из 37 микроскопических отверстий. С помощью такого шаблона Кетани в считанные минуты формировал массив из 888 миниатюрных колоний клеток в каждом из отверстий. Потом в те же самые отверстия можно поместить дополнительные клетки, поддерживающие жизнедеятельность колоний, лекарственные препараты и тому подобное.
В модельных экспериментах с препаратами известной токсичности такая структура «микропечени» позволила довольно быстро получить данные об уровне токсичности того или иного лекарства, согласующиеся с заранее известными.
Данная модель подразумевает использование замороженных клеток печени. Еще одним конкурентным преимуществом «печени на платформе» является скорость анализа того или иного лекарства — данные о токсичности препаратов могут быть получены на ранней стадии исследования в отличие от существующих методик, что позволяет сделать анализы более дешевыми.
