«Нобель» светится зелёным

«Нобель» по химии достался первооткрывателям флуоресцентного белка и его аналогов

Нобелевские лауреаты по химии 2008 года научили биологов исследовать молекулярные процессы внутри живых организмов. Чтобы узнать, где и в каком количестве появляются молекулы, достаточно посветить на живой организм ультрафиолетовой лампой.

В этом году Нобелевская премия была вручена за метод изучения биологических молекул.

Ее получили учёные из США — Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсиен (Цянь Юнцзянь) — «за открытие зелёного флуоресцирующего белка (GFP) и разработку методов его применения в науке». Присоединяя кодирующие этот GFP последовательности к встраиваемым в ДНК генам других белков, можно воочию увидеть, когда, где и сколько GFP – а значит, и интересующего нас белка – синтезирует живой организм.

Читайте также

Чтобы понять важность этих работ, достаточно взглянуть на проблемы, с которыми сталкиваются ученые при исследовании живого. Первыми на этом поприще были биохимики, установившие основные принципы работы живых систем и сформулировавшие основы функционирования катаболических и анаболических систем живой клетки. Они же впервые создали теорию ферментов – природных катализаторов чудовищной химической мощности. Во многом этому помогли структурные работы на основе методов γ-резонанса ядер и рентгеноструктурного анализа, позволившие узнать точную структуру белковых молекул в кристаллическом состоянии и в водном растворе.

В процессе познания живого, который шёл, образно говоря, «сверху вниз», во второй половине XX столетия большим подспорьем стали генетические методы, позволившие, в сочетании с новейшими вычислительными технологиями, взглянуть на основы жизни «снизу вверх» – от генов к белкам и их функциям к работе клеток, органов и целых организмов.

Однако ни генетикам, ни биохимикам не удавалось взять живое «живьём».

Ни первые, разглядывая последовательности нуклеотидов, ни вторые, вертящие в руках пластиковую модель белка, не могли до последнего времени взглянуть на работу молекул и тканей с хорошим пространственным и временным разрешением – ни внутри клетки, ни в межклеточном пространстве. А уж о том, чтобы делать какие-то количественные заключения о степени и скорости тех или иных молекулярных биологических процессов, и речи быть не могло.

Методики, делающие такие исследования возможными, появились сравнительно недавно и основываются на пионерских работах Симомуры, начатых на заре шестидесятых годов.

В 1955 году была впервые описана медуза Aequorea victoria, испускающая зеленое хемосинтетическое свечение. Заниматься изучением молекулярного механизма этого свечения выпало Осаму Симомуре, присоединившегося в 1960 году к коллективу принстонской лаборатории Фрэнка Джонсона. До этого Симомура работал в Нагойском университете, где изучал хемилюминесценцию небольших моллюсков остракодов под руководством профессора Хираты.

Разбираясь с флуоресценцией медузы, ученые первоначально наткнулись на белок, дающий синее свечение в присутствии ионов кальция; он получил название экворин. Синее свечение экворина озадачило ученых, так как сама медуза, в которой присутствовал этот белок, светилась зеленым.

Но вскоре после этого был выявлен и источник зелёного свечения, ныне известный под названием «зеленый флуоресцентный белок», GFP. Именно GFP стал «виновником торжества» спустя почти полвека.

Флуоресценция

кратковременная люминесценция.

Люминесценция – свечение вещества, происходящее после поглощения им энергии возбуждения. Впервые люминесценция была описана в XVIII веке. Первоначально понятие люминесценция относилось только к видимому свету. В настоящее время оно применяется к излучению в инфракрасном, видимом, ультрафиолетовом и рентгеновском диапазонах. Особого внимания люминесценция не привлекала вплоть до 1948 года, когда советский учёный Сергей Иванович Вавилов предложил использовать люминесценцию в анализе химических веществ. В быту явление люминесценции используется, главным образом, в люминесцентных лампах и электронно-лучевых трубках кинескопов.

Физическая природа люминесценции состоит в излучательных переходах электронов из возбуждённого состояния в основное. При этом причиной первоначального возбуждения системы могут служить различные факторы: внешнее излучение, химические реакции и другие.

Вещества, имеющие делокализованные электроны (сопряжённые системы), обладают самой сильной люминесценцией. Антрацен, нафталин, все белки, нуклеиновые кислоты, многие лекарственные препараты также обладают ярко выраженной способностью к люминесценции. Органические вещества, способные давать люминесцирующие комплексы со слабо люминесцентными неорганическими соединениями, часто используются в люминесцентном анализе. Так, в люминесцентной титриметрии часто применяется вещество флуоресцеин.

Многие формы природной люминесценции были известны людям очень давно. Например, свечение насекомых (светлячки), свечение морских рыб и планктона, полярные сияния, свечение минералов, гниющего дерева и других разлагающихся органических веществ. В настоящее время к природным формам прибавилось много искусственных способов возбуждения люминесценции. Твердые и жидкие вещества, способные люминесцировать, называют люминофорами (от лат. «свет» и греч. «несущий»).

Люминесцентное свечение тел принято делить на следующие виды:

фотолюминесценция – свечение под действием света (видимого и УФ-диапазона). Она, в свою очередь, делится на флуоресценцию (время жизни 10^-9-10^-6 с) и фосфоресценцию (10^-3-10 с);

хемилюминесценция – свечение, использующее энергию химических реакций;

катодолюминесценция – вызвана облучением быстрыми электронами (катодными лучами);

сонолюминесценция – люминесценция, вызванная звуком высокой частоты;

рентгенолюминесценция – свечение под действием рентгеновских лучей.

радиолюминесценция – при возбуждении вещества γ-излучением;

триболюминесценция – люминесценция, возникающая при растирании, раздавливании или раскалывании люминофоров. Триболюминесценция вызывается электрическим разрядами, происходящими между образовавшимися наэлектризованными частями - свет разряда вызывает фотолюминесценцию люминофора.

Ученые выяснили, что спектр возбуждения GFP совпадает со спектром свечения экворина, и первый, поглощая энергию ультрафиолетового света, испущенного вторым, преобразует её в ходе люминесценции в зеленый свет. Поначалу Симомура гораздо больше заинтересовался экворином, способным стать индикатором присутствия кальциевых ионов в живых системах, но через некоторое время переключился на исследования зеленого белка. В 1979 году он опубликовал статью, посвященную структуре этого природного соединения, и тогда же он корректно установил структурную часть белка, ответственную за хромофорные свойства.

Нобелевский комитет пришел к заключению, что без пионерских работ Симомуры, выполненных с помощью стандартных методик и с фирменным японским усердием, нам пришлось бы ждать революции зеленого флуоресцентного белка еще несколько десятилетий. Возможно, мы бы не дождались её никогда.

Мартин Чалфи подключился к зеленой эстафете сразу после защиты диссертации во время работы в Кембридже. Здесь в начале девяностых судьба свела его с Сидни Бреннером, которому в 2002 году суждено было стать лауреатом «нобелевки» по физиологии и медицине «за открытия в области генетического регулирования развития человеческих органов». Впервые услышав о зеленом флуоресцентном белке и зная о работах Бреннера, Чалфи воодушевился идеей экспрессии генов зеленого флуоресцирующего белка в других живых организмах.

Чалфи стал первым, кому удалось добиться экспрессии GFP в организмах кишечной палочки E.coli и нематоды С.elegans в его «естественной», флуоресцентной форме.

Именно эти работы показали возможность использования белка в качестве универсального генетического маркера. Именно здесь открылась возможность развития методов количественной оценки динамических биологических процессов непосредственно в живой клетке.

врез №
skin: article/incut(default)
data:

{
    "_essence": "test",
    "incutNum": 2,
    "pic_fsize": "86327",
    "picsrc": "Фотографии бактерии E.coli. Верхнее фото в левом столбце показывает вид бактерии в обычный оптический микроскоп. Фотографии со второй по четвертую и далее все снимки правого столбца отображают флуоресценцию зеленого белка, сцепленного с белком MinC. Интервал между снимками – пять секунд. Серия снимков тображает периодическое изменение концентрации белка у полюсов клетки, и показывапет, что наименьшая концентрация белка достигается в середине клетки, где развивающаяся перед делением клетки клеточная мембрана ингибирует экспрессию MinC. //Raskin D.M. & De Boer P.A./National Academy of Sciences",
    "repl": "<2>:{{incut2()}}",
    "uid": "_uid_2851793_i_2"
}

Роджер Тсиен присоединился к исследованию сразу после публикаций Чалфи. На рубеже веков он выполнил ряд масштабных работ, в которых смог раскрыть химию флуоресцентных параметров белка и его аналогов. Эти глубокие знания позволили впервые получить модификации белков, светящихся под действием ультрафиолета во всем видимом диапазоне. Его модифицированные белки показали более высокую интенсивность люминесценции и фотостабильность, были улучшены и многие другие характеристики.

После работ Тсиена стало возможно внедрять в живой организм биологические метки сразу несколько типов и раскрашивать интересующие ученых молекулы в самые разные цвета.

Сегодня семейство белков на основе зеленого флуоресцентного является джентльменским набором любого исследователя, сколько-нибудь серьезно занимающегося исследованием процессов в живых системах. Белок нетоксичен для организмов и может быть экспрессирован в больших количествах без влияния на протекания основных биологических процессов. Более того, зеленый белок, «прицепленный» к исследуемой природной молекуле генетически, не влияет на её функциональность, а сама метка сохраняет свою способность к флуоресценции.

В наши дни флуоресцентные белковые метки просто незаменимы при исследовании процессов экспрессии генов, локализации белков и их динамики, взаимодействия между белковыми молекулами, репликации и реорганизации хромосом, изучении транспортных каналов внутри клетки и так далее. Эти работы также спровоцировали развитие множества различных флуоресцентных методик исследования, которые позволили обойти дифракционный предел оптической микроскопии и наблюдать отдельные белковые молекулы в видимом диапазоне.